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人外周血淋巴細胞分離液(FICOLL配制)使用小貼士

發布時間: 2022-03-01  點擊次數: 174次

人外周血淋巴細胞分離液(FICOLL配制)使用小貼士 

 

 

產品簡介:
本產品是一種用于分離人外周血淋巴細胞的無菌、低內毒素水平的密度梯度分離液。其分離原理是根據血細
胞的密度差異(紅細胞和粒細胞密度為1.090 g/mL左右;淋巴細胞和單核細胞密度為1.075~1.090 g/mL;血小板為
1.030~1.035 g/mL),通過離心使一定密度的細胞按相應密度梯度分布,從而將淋巴細胞從人外周血或臍帶血中分
離出來。

 

使用步驟:

取新鮮抗凝全血(EDTA、枸櫞酸鈉或肝素抗凝均可)或者去纖維蛋白血液,用等體積的全血及組織稀釋液或者PBS稀釋全血。
2. 在離心管中加入適量分離液(當稀釋后血液體積小于3mL時,加入3mL分離液;大于等于3mL,加入等體積分離液。但二者的總體積不能超過離心管的三分之二,否則會影響分離效果),將稀釋后的血液平鋪到分離液液面上方,注意保持兩液面界面清晰。(可以使用巴氏德吸管吸取血液,然后將血液小心的平鋪于分離液上,因為兩者的密度差異,將形成明顯的分層界面。如果樣品較多加樣時間較長,在離心之前出現紅細胞成團下沉屬正?,F象。)
3. 室溫,水平轉子500~1000g,離心20~30min(血液的體積越大所需的離心力越大,離心時間越長,最佳的分離條件需摸索,離心轉速最大不超過1200g)。
4. 離心后將出現明顯的分層:最上層是稀釋的血漿層,中間是透明的分離液層,血漿與分離液之間的白膜層即為淋巴細胞層,離心管底部是紅細胞與粒細胞。
5. 小心的吸取白膜層細胞到15mL潔凈的離心管中, 10mL PBS或細胞洗滌液洗滌白膜層細胞。250g,離心10min。
6. 棄上清,5mL的PBS或細胞清洗液重懸細胞,250g,離心10min。
7. 重復步驟6
8. 棄上清,細胞重懸備用

 

注意事項:
A. 開封前顛倒混勻,本分離液為無菌產品,為延長分離液保存時間,請在無菌條件下啟封,避免微生物污染。
B. 分離液使用時應始終保持室溫(18℃~25℃),如室內溫度較低,可將分離液預熱。4℃或者是溫度較低的條件下離心,可能會導致白膜層中紅細胞污染加重。
C. 血液樣本最好為新鮮抗凝血(采血2 h以內),為保持淋巴細胞的活性,應避免冷凍和冷藏。
D. 稀釋血液或洗滌細胞,不可使用含Ca、Mg離子的緩沖液及培養液,其成分會導致血細胞凝集,大大降低細胞得率及純度。
E. 部分塑料制品(如聚苯乙烯)因其帶有的靜電作用,可能會導致細胞掛壁,影響分離效果。
F. 血液樣本的粘稠度或者是溫度差異,可能會影響分離效果,可以調節離心轉數和離心時間,摸索最佳的分離條件。
G. 吸取過多的淋巴細胞層及分離液層會導致分離液交界處的粒細胞被吸出從而使混雜的粒細胞數量增加;吸取過多的血漿層可能會導致淋巴細胞中血漿蛋白及血小板污染。
H. 如果要進一步對分離的細胞進行培養,那在收集血液和分離過程中,注意無菌操作,避免微生物污染。
I. 不同動物血液在不同比重分離液中的細胞離散系數及細胞帶電不同,用戶在制定分離液時應提供所需分離液的比重、動物種屬及被分離細胞的名稱。

 

 

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